BIOLOGÍA DEL SUELO

Impacto a largo plazo de la fertilización sobre la estructura y funcionalidad de la comunidad microbiana del suelo

Long-term impact of fertilization on the structure and functionality of microbial soil community

Jimena Ortiz^1*; Valeria Soledad Faggioli¹; Hugo Ghio²; Monica Fabiola Boccolini¹; Juan Pablo Ioele¹; Pablo Tamburrini³; Fernando O. Garcia⁴; Vicente Gudelj¹

¹ Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Argentina
² Asociación Argentina de Productores en Siembra directa (AAPRESID). Argentina
³ Nutrien Ag Solutions. Argentina
⁴ Facultad de Ciencias Agrarias (UNMdP), Balcarce, Argentina.
* Autor de contacto: ortiz.jimena@inta.gob.ar

Recibido: 20/12/2018
Recibido con revisiones: 25/11/2019
Aceptado: 03/12/2019

RESUMEN
Para un manejo sustentable no se deben desconocer los efectos de la fertilización sobre el suelo y sus procesos microbianos. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto acumulado de diferentes dosis de fertilización sobre las comunidades microbianas del suelo en dos profundidades (0-5 cm y 5-10 cm). El trabajo se realizó sobre un ensayo de campo con aplicación incorporada de fertilizantes desde 1999. Las dosis de fertilización evaluadas fueron: testigo (T), dosis de productor (DP), dosis de reposición (DR) y dosis de reposición con agregado de micronutrientes (DRM). Se midieron variables de estructura (DGGE), actividades enzimáticas de hidrólisis del diacetato de fluoresceína, fosfatasa ácida, ureasa y arilsulfatasa, nitrógeno potencialmente mineralizable (NAN) y glomalinas. La fertilización afectó diferencialmente las funciones microbiológicas en las dos profundidades. Los valores de ureasa fueron mayores en T a 0-5 cm. Los valores de NAN fueron superiores en T y DP a 0-5 cm y en T a 5-10 cm. En cambio, fosfatasa y glomalinas predominaron en DR y DRM. La acidez del suelo y volumen de rastrojo generados por la fertilización habrían ocasionado los elevados valores de fosfatasa y glomalinas. La disminución de NAN en altas dosis de fertilización respondería al incremento de la mineralización generado por el agregado de nutrientes (efecto "priming"). La estructura de la comunidad microbiana fue afectada por la fertilización en diferente medida según la profundidad de muestreo. En 0-5 cm la riqueza y diversidad fueron similares entre tratamientos. En cambio, en 5-10 cm, ambos índices fueron drásticamente afectados por la aplicación de fertilizantes. El índice de diversidad de Shannon fue de 2,21 y 2,20 en T y DP; y 1,4 y 1,39 en DR y DRM. Sólo se hallaron correlaciones significativas entre la actividad enzimática y la comunidad bacteriana en la profundidad 0-5 cm. El mantenimiento de la sustentabilidad de los agroecosistemas depende en gran medida del equilibrio entre la estructura y las funciones biológicas provistas por los microorganismos del suelo. Esperamos que este aporte constituya una herramienta más para tener en cuenta al momento de tomar decisiones sobre el manejo de fertilización a largo plazo en cultivos.

Palabras claves: Actividad enzimática, DGGE, nitrógeno potencialmente mineralizable, comunidad bacteriana.

ABSTRACT
To understand effects of fertilization on microbial communities and processes a long-term fertilization treatment was performed. Since 1999, a field experiment was conducted and variables of structure (DGGE), enzymatic activity (phosphatase, urease, arylsulfatase), potentially mineralizable nitrogen (NAN) and glomalins were measured at two depths (0-5 cm and 5-10 cm). At both depths, fertilizer rates affected microbiological functions of the biomass community differentially. Urease activity was higher for the Control treatment at 0-5 cm depth, while NAN activity was higher for the Control and the Farmer Rate treatment at 0-5 cm and also in the Control treatment at 5-10 cm depth. Phosphatase and glomalin levels were higher for Reposition Rate treatment. Soil acidity and harvest residue volume generated by fertilization could have caused high phosphatase and glomalins values. NAN decrease at higher fertilization rates could have been caused by the mineralization increase generated by the nutrient addition ("priming" effect). Microbial community structure was affected differently by fertilization according to sampling depth. At 0-5 cm depth, richness and evenness were similar between treatments, while at 5-10 cm depth, both indexes were drastically affected by fertilizer application. Evenness was 2.21 and 2.20 for Control and Farmer Rate treatment, and 1.4 and 1.39 for Reposition Rate treatment. Significant correlations were found between the enzymatic activity and the microbial structure at 0-5 cm depth. The sustainability of agroecosystems depends on the balance between the structure and the biological functions provided by soil microorganisms. We hope this study will be crop management decision tool.

Keywords: Enzymatic activity, DGGE, potentially mineralizable nitrogen, bacterial community.

INTRODUCCIÓN

El uso de fertilizantes es una de las prácticas de manejo más importantes para suplir nutrientes e incrementar el rendimiento de los cultivos y la calidad del grano. En cada campaña, nitrógeno (N), fósforo (P) y azufre (S) son aportados para la producción de cereales y oleaginosas. Los cultivos de mayor importancia económica en Argentina son maíz, trigo y soja que ocupan 4,25; 3,7 y 20,7 mill ha, respectivamente, con una dosis promedio de fertilizantes de 186; 131 y 46 kg ha^-1 (Fertilizar, 2016).

Aunque la fertilización va destinada a los cultivos, también incide sobre los organismos que habitan el suelo debido a las alteraciones en las propiedades del físico-químicas (Correa, 2016). Al aplicar un fertilizante, la alteración inmediata es el incremento en la disponibilidad de nutrientes, pero a largo plazo la acidificación del suelo es el principal efecto negativo causado por la práctica de fertilización (Wallace, 1994). Una revisión de 34 casos analizados demostró que en 84% de los mismos la comunidad microbiana fue sensible a la fertilización (Geisseler & Scott, 2014). Zhalnina et al., (2015) observaron que los cambios en la composición, diversidad y biomasa microbiana se debieron al pH del suelo. En tanto que, a partir de un relevamiento a escala global, Fierer (2017) realizó una jerarquización de los factores bióticos y abióticos que influyen sobre las comunidades bacterianas y halló que el pH del suelo es el parámetro de mayor importancia.

Los microorganismos del suelo intervienen en el ciclo de los nutrientes a través de la regulación de los procesos de mineralización de materia orgánica y mantenimiento de los stocks de nutrientes en el suelo. Las técnicas moleculares han permitido un gran avance en el estudio de la composición de las comunidades microbianas (Van Elsas et al., 2019). En tanto que las maneras más habituales de cuantificar las funciones llevadas a cabo por los microorganismos es través de la actividad de enzimas tales como la fosfatasa, arilsulfatasa y ureasa que intervienen en la mineralización de P, S y N, respectivamente (Nannipieri et al., 2003; Ferreras et al., 2009). Los nutrientes retenidos en estructuras orgánicas representan una medida de su grado de conservación dentro del sistema (Hisrch, 2019). Por ejemplo, fracciones del N orgánico pueden estimarse a través del N potencialmente mineralizable (NAN) y en estructuras proteicas del suelo, tales como las denominadas "glomalinas" (Wright & Upadhyaya, 1999; Echeverría et al., 2000). Esta última también se ha citado como un agente cementante de agregados (Rillig, 2004). Un suelo estable mantendrá una óptima diversidad biológica y un equilibrio entre la conservación de recursos y la mineralización.

El impacto de la fertilización sobre los microorganismos depende del tipo de fertilizante, la dosis y el método de aplicación (Soares Rosado et al., 2019). Numerosos estudios tendientes a cuantificar el efecto de prácticas agronómicas sobre comunidades microbianas del suelo se realizaron a una determinada profundidad en los primeros centímetros de la superficie (Chakraborty et al., 2011; Boccolini et al., 2016; Correa, 2016). Sin embargo, la incorporación subsuperficial de fertilizantes podría afectar a los microorganismos que habitan en capas más cercanas al sitio de la aplicación (Geisseler & Scott, 2014). El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto acumulado de diferentes dosis de fertilización sobre la composición y funcionalidad de las comunidades microbianas del suelo en dos profundidades (0-5 cm y 5-10 cm).

MATERIALES Y MÉTODOS

Descripción del ensayo y diseño experimental

El estudio se realizó en un ensayo de fertilización de larga duración iniciado en el año 1999 en Camilo Aldao, provincia de Córdoba (33° 11' 20,09'' S, 61° 58´ 49,34´´ O). El suelo del sitio es un Argiudol Típico de textura franco limosa perteneciente a la serie Hansen (INTA, 1985). El diseño experimental fue de franjas de 6000 m² para cada tratamiento (30 m de ancho por 200 m de largo). La rotación realizada fue maíz - trigo/soja. Los tratamientos evaluados fueron: Testigo sin fertilización (T) y tres situaciones de fertilización con NPS: Dosis de productor (DP), Dosis de reposición (DR) y Dosis de reposición con el agregado de micronutrientes (Zn y B) (DRM). La dosis de productor fue 80 Kg ha^-1 de N, 17 Kg ha^-1 de P y 15 Kg ha^-1 S, para maíz, y 80 Kg ha^-1 de N, 21 Kg ha^-1 de P y 14 Kg ha^-1 S, para trigo/soja.

La determinación de la dosis de reposición se realizó en función de un rendimiento objetivo definido para cada cultivo y los requerimientos por tonelada de grano de cada uno de ellos, utilizando el valor referenciado de Echeverría & García (2014). En maíz se definió un rendimiento objetivo de 12000 kg ha^-1, por lo cual se aplicó 264 kg ha^-1 de N; 48 kg ha^-1 de P y 48 kg ha^-1 de S en DR, mientras que en el tratamiento DRM se aplicó además de la dosis anterior 0,24 kg ha^-1 de B y 0,64 kg ha^-1 de Zn. Para el trigo se definió un rendimiento de 5000 kg ha^-1 y se aplicó 150 kg ha^-1 de N, 25 kg ha^-1 de P y 25 kg ha^-1 de S para el tratamiento DR, mientras que en el tratamiento DRM se aplicó además de la dosis anterior 0,125 kg ha^-1 de B y 0,26 kg ha^-1 de Zn. En soja se definió un rendimiento de 3400 kg ha^-1 y se consideró que un 60% del N de la soja proviene de la fijación biológica, según lo evaluado por Salvagiotti et al. (2015), por lo cual la aplicación de fertilizante en el tratamiento DR fue 102 kg ha^-1 de N, 23,8 kg ha^-1 de P y 15,3 kg ha^-1 de S, mientras que en el tratamiento DRM se aplicó además 0,085 Kg ha^-1 de B y 0,20 Kg ha^-1 de Zn.

La aplicación de los fertilizantes se realizó anualmente en las mismas parcelas, según el tratamiento, por debajo al costado de la semilla (N y S) o en la línea de siembra (P).

El muestreo se realizó previo a la siembra del cultivo estival en septiembre de 2015 (16 años de duración del experimento). La toma de muestras fue realizada teniendo en cuenta un área representativa dentro de cada franja de 6000 m². Cada área fue dividida en tres subáreas (20x 100 m), a lo largo de las cuales se tomaron muestras compuestas por 20 submuestras cada una, a dos profundidades: 0-5 y 5-10 cm; de manera de obtener pseudoréplicas para cada tratamiento, ya que cada parcela representa un tratamiento y por lo tanto no es posible obtener réplicas verdaderas dadas las características del experimento. Las muestras fueron tamizadas (malla de 2 mm), y una fracción de la muestra se conservó a 4ºC hasta la determinación de la actividad microbiana y otra porción se conservó a -20ºC para la extracción del ADN genómico.

Determinaciones en suelo

El pH del suelo fue medido a una relación suelo agua 1:2,5 (IRAM 29410, 1999). Las variables microbiológicas medidas fueron: actividad enzimática global por la hidrólisis de fluoresceína diacetato (FDA) (Adam & Ducan, 2001), actividad de fosfatasa ácida (Tabatabai & Bremner, 1969), ureasa (Tabatabai & Bremner, 1972) y arilsulfatasa (Tabatabai & Bremner., 1970), nitrógeno anaeróbico potencialmente mineralizable (NAN) (Echeverría et al., 2000) y proteínas fácilmente extraíbles reactivas a Bradford, comúnmente denominadas "glomalinas" (Wright & Upadhyaya, 1999).

La extracción de ADN se realizó a partir de 0,25 g de suelo con kit comercial Power soil (MO BIO Laboratories, Inc. Carlsbad, CA). Para la amplificación del gen 16S ARNr se realizó una PCR con el set de primers R534 y F341-GC que codifican para la región variable V3 de 200 pb (Muyzer et al., 1994). Los productos PCR fueron separados en electroforesis mediante la técnica DGGE (Muyzer et al., 1993). Se prepararon geles de poliacrilamida al 8% con un gradiente lineal desnaturalizante de 40 a 60%. Las condiciones de electroforesis fueron a 60 V durante 16 h a 60°C. Los geles se tiñeron con GelRed en TAE 1X durante 45 min y se visualizaron bajo luz UV. Los perfiles DGGE fueron digitalizados y analizados con el software Gel Compare II (Applied Maths). La posición y la intensidad de las bandas fueron utilizadas para posteriores análisis estadísticos y estimación de índices de diversidad Shannon- Wiener (Shannon, 1948) y riqueza (Menhinick, 1964).

Análisis estadístico

Para el análisis estadístico de los datos microbiológicos se utilizó el programa InfoStat (Di Rienzo et al., 2017). Se aplicó un Modelo Lineal Generalizado Mixto (MLGM) tomando como efecto fijo los tratamientos de fertilización y las profundidades, y como efectos aleatorios a las repeticiones de campo. Cuando el p-valor del test fue p<0,05 se compararon las medias por el test DGC con significancias del 5%. La comparación en la composición de las comunidades se realizó mediante análisis de permutaciones y múltiple ANOVA (permanova). El gráfico de composición de comunidades se realizó en base a un PCO (Principal Coordinate Analysis) con el paquete labsdv de R (R Development Core Team, 2018). Se estimaron correlaciones lineales entre las variables microbiológicas y las comunidades bacterianas con la función envfit del paquete vegan del software R, sólo se graficaron los vectores correlacionados significativamente (p<0,05). También se realizó el análisis de correlación de Pearson entre el pH y la riqueza y diversidad de bacterias.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Comportamiento del pH del suelo

Una de las consecuencias negativas ocasionadas por la fertilización mineral es la disminución del pH del suelo. En este estudio los valores de pH fueron mayores en T respecto a los tratamientos DP, DR y DRM, tanto para la profundidad de 0-5 cm como para la profundidad de 5-10 cm. Hubo una disminución significativa del 10% 19%, y 20% del valor del pH entre T y los tratamientos DP, DRM y DR, respectivamente, en la profundidad de 0-5 cm (MGLM, p<0,05) (Tabla 1). Mientras que en la profundidad de 5-10 cm, la disminución fue de 6%, 13%, y 16% entre T y los tratamientos DP, DRM y DR, respectivamente (MGLM, p<0,05) (Tabla 1). Estos resultados concuerdan con estudios sobre ensayos de larga duración con fertilización mineral (Liang et al., 2014; Boccolini et al., 2016). Además, nuestra investigación demuestra que la reducción del pH se mantuvo y con la misma tendencia en ambos estratos muestreados (i.e. 0-5 cm y 5-10 cm).

Comportamiento microbiológico del suelo
Funcionalidad de la comunidad microbiana

Las variables microbiológicas respondieron de manera diferencial según profundidad y dosis de fertilización (Tabla 1). La actividad enzimática global medida a través de FDA no fue afectada por las prácticas de fertilización, presentando los mayores valores en el estrato superficial (MGLM, p<0,05) (Tabla 1)). Esto responde a que a medida que se aumenta la distancia desde la superficie disminuye el número de microorganismos y sus actividades enzimáticas (Frey, 2007). Nuestros resultados coinciden con Morales et al., (2016), quienes, en un suelo Hapludalf Típico en 0-10 cm de profundidad, luego de nueve años de fertilización mineral no observaron efectos significativos en la actividad de FDA. Mientras que Chakraborty et al., (2011) observaron mayor actividad de FDA en los tratamientos con fertilización mineral de NPK respecto al tratamiento control sin fertilización luego de 37 años. La ausencia de respuesta a la fertilización entre T y las diferentes estrategias de fertilización evaluadas en este estudio indica que la FDA es una variable biológica estable frente al efecto acumulado de la fertilización a largo plazo.

Tabla 1. Valores medios de pH del suelo, actividades enzimáticas (FDA, fosfatasa, arilsulfatasa, ureasa), nitrógeno potencialmente mineralizable (NAN) y glomalinas en los diferentes tratamientos de fertilización a 0-5 cm y 5-10 cm de profundidad.
Table 1. Mean soil pH, enzymatic activity (FDA, phosphatase, arylsulfatase, urease), anaerobic nitrogen (NAN) and glomalin values per fertilization treatment at 0-5 cm and 5-10 cm depth.
(*) Corresponde a compuestos proteicos reactivos a Bradford. Letras diferentes entre filas de una misma columna indican diferencias estadísticas significativas según MLGM y test DGC nivel de significancia 5%.

Respecto a las variables microbiológicas que respondieron a las dosis de fertilización, se hallaron dos grupos, uno conformado por fosfatasa y glomalina que respondieron con mayores valores en los tratamientos de mayor fertilización (i.e. DR y DRM), y un segundo grupo conformado por ureasa y NAN que tuvieron mayores valores en los tratamientos de nula a menor fertilización (i.e. T y DP) (MGLM, p<0,05) (Tabla 1).

Para los primeros 5 cm, la actividad fosfatasa y glomalina presentaron valores superiores en los tratamientos DR y DRM. La glomalina, además, fue mayor en el tratamiento DR en la profundidad de 5-10 cm (MGLM, p<0,05) (Tabla 1). Las glomalinas son sustancias compuestas por proteínas, lípidos y materiales húmicos altamente resistentes. Su presencia en el suelo ha sido vinculada a mejoras en las propiedades físicas del suelo y como una fuente de almacenamiento de N y C de larga duración (Rillig et al., 2001). Aumentos en los contenidos de glomalinas en altas dosis de fertilización se han relacionado al aporte de material vegetal (Jun et al., 2007), altos contenidos de P del suelo (Wu et al., 2011) y siembra directa (Dai et al., 2017). El mayor volumen de material vegetal en los tratamientos de alta fertilización podría explicar los mayores contenidos de glomalinas en DR y DRM en relación con los tratamientos T y DP a la profundidad de 0-5 cm.

Dick et al. (2000) observaron que la mayor actividad de la fosfatasa ácida se registró en rangos de pH de 5 a 5,5, mientras que por encima de esos valores la enzima disminuyó drásticamente en el suelo. En dicha investigación, el contenido de P no afectó la actividad fosfatasa, es decir, se observaron altos valores de fosfatasa en situaciones de elevada oferta de P. En cambio, DeForest et al. (2012) hallaron que el comportamiento de la enzima fue dependiente de la biodisponibilidad inicial de P, observando una disminución de la actividad enzimática al agregarle P al suelo. Nuestros resultados coinciden con lo hallado por Dick et al. (2000), es decir, la actividad fosfatasa ácida fue significativamente mayor en los tratamientos con bajo pH (DR y DRM) (MGLM, p<0,05) (Tabla 1). En un estudio realizado sobre el mismo experimento, se observó que dichos tratamientos presentaban los mayores valores de P extractable, con niveles de P (mg kg^-1) iguales a 39,9 en DRM; 38,9 en DR; 8,5 en DP; 4,7 en T (Gudelj et al., 2017). Es decir que, en nuestra investigación, la mayor biodisponibilidad de P no inhibió la actividad enzimática tal como lo observó DeForest et al. (2012). Sin embargo, son necesarias más investigaciones tendientes a profundizar sobre la interacción de la biodisponibilidad de P y pH del suelo en ambientes de alta disponibilidad de P para comprender las consecuencias que los cambios en las propiedades del suelo producen en las funciones de las fosfatasas en el agroecosistema.

Las variables relacionadas al ciclo del N, ureasa y NAN, mantuvieron una tendencia similar de respuesta a los tratamientos de fertilización en ambas profundidades (Tabla 1). En 0-5 cm de profundidad, la actividad de la ureasa presentó los mayores valores en T, seguido de los tratamientos DP, DR y, por último, el tratamiento DRM (MGLM, p<0,05) (Tabla 1). En 5-10 cm de profundidad, los contenidos de ureasa en T se igualaron a los contenidos del tratamiento DP, diferenciándose de los tratamientos DRM y DR, los cuales presentaron un contenido inferior (MGLM, p< 0,05) (Tabla 1). De manera similar, la variable NAN en 0-5 cm de profundidad fue superior en los tratamientos T y DP respecto a DRM y DR. En tanto que a 5-10 cm de profundidad, T registró el mayor valor en comparación con el resto de los tratamientos (MGLM, p<0,05) (Tabla 1). Boccolini et al. (2016) también registró un menor contenido de NAN en las situaciones con mayores dosis de fertilizantes en un ensayo de fertilización nitrogenada de larga duración. Los autores sugieren que dicho comportamiento de NAN podría deberse a un aumento en la velocidad de mineralización de la materia orgánica particulada como consecuencia de la aplicación de N (Galantini et al., 2008). Este efecto de la fertilización es denominado "priming" y se menciona con frecuencia asociado a la disminución de N potencialmente mineralizable (NAN) debido a que la aplicación de N aumenta el volumen de aportes de N orgánico y, como consecuencia se reduce el pool de N mineralizable del suelo (Kuzyakov et al., 2000). Es probable, que este mecanismo también genere una menor actividad de las enzimas relacionadas al ciclo de N, tal como la ureasa. La disminución de esta enzima en respuesta a la fertilización nitrogenada ha sido citada por otros autores quienes la proponen como un indicador del grado de disturbio en los procesos biológicos debido a la fertilización (Ajwa et al., 1999).

Las funciones relacionadas al ciclo del S fueron evaluadas mediante la actividad de la enzima arilsulfatasa (Tabla 1). En superficie (0-5 cm), presentó mayores valores en los tratamientos T, DP y DR; mientras que a la profundidad de 5-10 cm presentó mayores valores en los tratamientos DR y DRM (MGLM, p<0,05) (Tabla 1). Similares resultados fueron reportados por Prietzel et al. (2001) quienes luego de una fertilización observaron que la actividad de la enzima arilsulfatasa en superficie (0-10 cm) era mayor en los tratamientos control respecto al tratamiento fertilizado, mientras que a mayor profundidad en ciertas épocas del año la actividad de la enzima aumentaba en los tratamientos fertilizados respecto al control sin fertilizante. Por otro lado, Liang et al. (2014) no observaron diferencias en la actividad de la enzima tanto en superficie como en profundidad, luego de 15 años de fertilización de reposición en una rotación Trigo-Maíz.

Estructura de la comunidad microbiana

La estructura de la comunidad bacteriana, estudiada mediante DGGE, fue afectada significativamente por los tratamientos de fertilización en diferente medida de acuerdo con la profundidad de muestreo (Figura 1). En los primeros 0-5 cm se registraron valores de riqueza (número de especies) y diversidad (índice de Shannon) similares en todos los tratamientos de fertilización (MLGM, p>0,05) (Figura 2a, Figura 3a). En cambio, en la profundidad 5-10 cm, tanto la riqueza como la diversidad fueron significativamente menores en los tratamientos de alta fertilización DR y DRM (MLGM, p<0,05) (Figura 2b, Figura 3b). El efecto negativo de la fertilización mineral a largo plazo sobre la comunidad bacteriana del suelo ha sido reportado por Marschner et al. (2003). Del mismo modo, Ge et al. (2008) observaron que la riqueza y diversidad de bacterias disminuyó en tratamientos con fertilización mineral nitrogenada en comparación con la aplicación de enmiendas y fertilización sin N. Esta disminución se asocia a que la fertilización disminuye el pH del suelo y las bacterias se desarrollan mejor en pH cercanos a la neutralidad (Fierer, 2017). En este estudio el efecto del pH del suelo sobre la comunidad de bacterias fue evidenciado por el análisis de correlación de Pearson. Se observó una correlación altamente positiva y significativa entre el pH y la riqueza (Pearson, 0-5cm: r2=0,27, p<0,05; 5-10cm: r2=0,90, p<0,01), y el pH y la diversidad (Pearson, 0-5cm: r2=0,30, p<0,05; 5-10cm: r2=0,91, p<0,01). Similares resultados fueron reportados por Lauber et al. (2009) quienes luego de realizar pirosecuenciación de 88 suelos, observaron que la diversidad filogenética de las comunidades bacterianas se correlacionó con el pH del suelo (R2= 0,50), con picos de diversidad en suelos con pH cercanos a la neutralidad.

Figura 1. Conglomerados según Dice y UPGMA en base a DGGE de amplicones 16S rRNA T: Testigo, DP: Dosis de productor, DR: Dosis de reposición, DRM: DR + micronutrientes; (0-5) y (5-10) indican las profundidades (cm). I, II y III: Repeticiones de cada tratamiento. Se presenta sombreado el cluster que se separó del resto de los tratamientos.
Figure 1. Conglomerates according to Dice and UPGMA based on DGGE of 16S rRNA amplicons. T: Control without fertilization, DP: Farmer rate, DR: Replacement rate, DRM: DR + micronutrients; (0-5) and (5-10) indicate the depths (cm). I, II and III: Repetitions per plot. The cluster that was separated from the rest of the treatments was shaded.

Figura 2. Riqueza de especies (número de bandas) obtenida mediante amplificación del gen 16S rRNA y DGGE a partir de muestras de suelo con diferentes tratamientos de fertilización: T: control sin fertilización, DP: Dosis de productor, DR: Dosis de reposición, DRM: Dosis de reposición más micronutrientes. A. profundidad 0-5 cm. B. Profundidad 5-10 cm. Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos de la misma profundidad (MLGM, Test DGC 5%).
Figure 2. Species richness (number of bands) obtained by amplification of the 16S rRNA gene and DGGE from soil samples with different fertilization plots: T: control without fertilization, DP: Farmer rate, DR: Replacement rate, DRM: Replacement rate + micronutrients. A. Depth 0-5 cm. B. Depth 5-10 cm. Different letters indicate statistically significant differences between plots for the same depth (MLGM, DGC Test 5%).

Figura 3. Diversidad de especies (índice Shannon-Wiener) obtenida mediante amplificación del gen 16S rRNA y DGGE a partir de muestras de suelo con diferentes tratamientos de fertilización: T: control sin fertilización, DP: Dosis de productor, DR: Dosis de reposición, DRM: Dosis de reposición más micronutrientes. A. profundidad 0-5 cm. B. Profundidad 5-10 cm. Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos de la misma profundidad (MLGM, Test DGC 5%).
Figure 3. Species diversity (Shannon-Wiener index) obtained by amplification of the 16S rRNA gene and DGGE from soil samples with different fertilization plots: T: control without fertilization, DP: Farmer rate, DR: Replacement rate, DRM: Replacement rate+ micronutrients. A. Depth 0-5 cm. B. Depth 5-10 cm. Different letters indicate statistically significant differences between plots of the same depth (MLGM, DGC Test 5%).

Se observaron diferencias estadísticamente significativas en la composición de las comunidades de 0-5 cm vs 5-10 cm (permanova, R=0,52; p<0,01), y entre tratamientos de fertilización (permanova, R=0,21; p<0,01). La relación entre la composición de la comunidad microbiana, el pH y las variables de funcionalidad microbiana se representan en la Figura 4A y B). Las comunidades bacterianas del suelo en T y DP presentaron mayor similitud entre sí que con los tratamientos de altas dosis de fertilización (i.e. DR y DRM) para ambas profundidades (0-5 cm: permanova, r=0,20; p<0,007; 5-10 cm: permanova, r=0,43; p<0,001) (Figura 4A y B). En los primeros 5 cm, las actividades enzimáticas, glomalinas, pH y NAN se correlacionaron con la composición de las comunidades microbianas tal como se observa en la Figura 4A) a través de los vectores cuya dirección y longitud representan el sentido y significancia de la correlación, respectivamente (envfit, p<0,05). La comunidad bacteriana de los tratamientos de menor fertilización (T y DP) correlacionó con pH, NAN y actividad de ureasa (Figura 4A, envfit p<0,05), mientras que ante mayores dosis de fertilización (i.e. DR y DRM), correlacionó con actividad de fosfatasa y contenido de glomalinas (Figura 4A, envfit p<0,05). Podría inferirse que frente a limitaciones nutricionales presentes en T y DP, se incrementaron las funciones relacionadas al ciclo del nitrógeno, el principal macronutriente requerido por los cultivos. En las situaciones de mayor fertilización, en cambio, las alteraciones de las propiedades químicas del suelo, favorecieron aquellos procesos que demandan bajos valores de pH, como es el caso de las fosfatasas ácidas. Finalmente, en la profundidad 5-10 cm, la composición de la comunidad bacteriana solo correlacionó con pH (envfit, p<0,05) (Figura 4B). Los tratamientos que presentaron mayor acidificación (DR y DRM) mantuvieron su efecto sobre las comunidades microbianas en la capa sub-superficial del suelo. Nuestros resultados demuestran que las bacterias son sensibles a la acidificación del suelo producto del uso prolongado de fertilizantes y que los efectos negativos se manifiestan tanto en los primeros cm como en la capa sub-superficial de 5-10 cm. Sin embargo, aunque el pH constituye el mejor predictor de la composición de las comunidades bacterianas del suelo (Fierer, 2017), no todas las especies responden iguales. Es decir, mientras algunas son muy sensibles a los cambios de pH, otras son cosmopolitas y se adaptan a un gran rango de condiciones (Delgado-Baquerizo et al., 2018). Por ejemplo, Rousk et al. (2010) observaron predominio de acidobacterias en pH más bajos y nitrosospira, α-, β-, y δ-Proteobacteria en pH más altos. Por su parte, Boccolini et al. (2016) observaron que la diversidad de bacterias oxidantes de amoniaco aumento en los sitios de mayor fertilización que a su vez tuvieron una disminución significativa en los valores de pH.

Figura 4. Análisis de composición de comunidades bacterianas (PCO) obtenidas mediante amplificación de gen 16S rRNA y DGGE a partir de muestras de suelo con diferentes tratamientos de fertilización: T: testigo sin fertilización, DP: Dosis de productor, DR: Dosis de reposición, DRM: Dosis de reposición más micronutrientes. A. Profundidad 0-5 cm. B. Profundidad 5-10 cm. Los vectores representan correlaciones lineales estadísticamente significativas (p<0, 05) entre las comunidades bacterianas y actividad enzimática, NAN, glomalinas y pH. La dirección del vector indica el sentido del gradiente y su longitud representa la significancia estadística.
Figura 4. Analysis of composition of bacterial communities (PCO) obtained by amplification of 16S rRNA gene and DGGE from soil samples with different fertilization treatments: T: control without fertilization, DP: Farmer rate, DR: Replacement rate, DRM: Replacement rate + micronutrients. A. Depth 0-5 cm. B. Depth 5-10 cm. The vectors represent statistically significant linear correlations (p <0,05) between bacterial communities and enzymatic activity, NAN and glomalin. The direction of the vector indicates the direction of the gradient and its length represents the statistical significance.

CONCLUSIONES

Para los primeros 5 cm, la fertilización afectó la estructura de la comunidad bacteriana observándose cambios en la composición de las comunidades. También afectó la funcionalidad, con aumentos en las fosfatasas y glomalinas y disminución de actividad ureasa y NAN ante incrementos de las dosis de fertilización.

En la capa sub-superficial (5-10cm), en cambio, la fertilización no sólo generó cambios en la composición de la comunidad bacteriana del suelo sino que también se observaron reducciones significativas de la riqueza y diversidad frente a dosis de reposición de nutrientes (DR y DRM). En términos generales, aunque la funcionalidad biológica fue menor, hubo respuesta a la fertilización registrándose elevados valores de glomalinas y arilsulfatasa en alta dosis de fertilización; y de NAN en ausencia de fertilización.

Tales diferencias estuvieron asociadas a los efectos de la fertilización sobre el pH del suelo debido al historial de 16 años ininterrumpidos de aplicación de fertilizantes.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue financiado por del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) a través de los proyectos PNCY0 1127032, PNCYO 1127033 y CORDO 1262101; y también por el Instituto Internacional de Nutrición de Plantas (IPNI), la Asociación Argentina de Productores en Siembra directa (AAPRESID) y Nutrien Ag Solutions.

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