[article pii="nd" doctopic="oa" language="es" ccode="conicyt" status="1" version="4.0" type="ilus gra tab" order="03" seccode="cds010" sponsor="nd" stitle="Cienc. suelo" volid="34" issueno="1" dateiso="20160600" fpage="21" lpage="31" issn="1850-2067"]TRABAJOS
[front][titlegrp][title language="es"]Impacto de la aplicación prolongada de urea sobre bacterias nitritantes de un Argiudol típico, Argentina[/title][/titlegrp]
[authgrp][author role="nd" rid="a01"][fname]Mónica Fabiola[/fname] [surname]Boccolini[/surname][/author]1*; [author role="nd" rid="a02"][fname]Laura Ana[/fname] [surname]Basile[/surname][/author]2; [author role="nd" rid="a01"][fname]Cristian Román[/fname] [surname]Cazorla[/surname][/author]1; [author role="nd" rid="a01"][fname]Carlos Martín[/fname] [surname]Galarza[/surname][/author]1; [author role="nd" rid="a01"][fname]Belén[/fname] [surname]Conde[/surname][/author]1 & [author role="nd" rid="a03"][fname]Eva Lucía Margarita[/fname] [surname]Figuerola[/surname][/author][/authgrp]3
1 [aff id="a01"
orgname="Estación Experimental Agropecuaria INTA Marcos Juárez"]Estación Experimental Agropecuaria
INTA Marcos Juárez[/aff]
2 [aff
id="a02" orgname="Universidad Nacional de San Martin"
orgdiv1="Instituto de Investigaciones Biotecnológicas"]Instituto de Investigaciones
Biotecnológicas-Universidad Nacional de San Martin[/aff]
3 [aff
id="a03" orgname="Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética
y Biología Molecular ‘‘Héctor Torres’’"]Instituto de Investigaciones en
Ingeniería Genética y Biología Molecular ‘‘Héctor
Torres’’[/aff]
*Autor de contacto: boccolini.monica@inta.gob.ar
[bibcom][hist]Recibido: [received
dateiso="20150707"]07-07-15[/received]
Recibido con revisiones: [revised dateiso="20151013"]13-10-15[/revised]
Aceptado: [accepted dateiso="20151015"]15-10-15[/accepted][/hist]
RESUMEN
[abstract language="es"]La oxidación del amoníaco a nitrito constituye un paso crítico en el ciclo del nitrógeno (N) y es realizado por las bacterias oxidantes del amoníaco (BOA) o Nitritantes. El manejo agrícola puede afectar la comunidad de las BOA a través del uso prolongado de fertilizantes nitrogenados como la urea, cuya aplicación tiende a aumentar la acidez del suelo. El tamaño, actividad, composición de las BOA y variables químicas de suelo fueron investigadas luego de 12 años de fertilizaciones con urea. El ensayo presenta un diseño en bloques completos aleatorizados con tres repeticiones sobre un suelo Argiudol típico de Marcos Juárez, Sudeste de Córdoba, Argentina. Los tratamientos fueron: A como control sin aplicación; B y C con 95 y 165 kg ha-1 de urea como fuente de N, respectivamente. Se realizaron dos muestreos: previo a la siembra y en postcosecha de maíz. Para la caracterización de la comunidad de BOA se utilizaron los métodos del número más probable, shaken soil slurry, reacción en cadena de la polimerasa y electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante. La fertilización con urea disminuyó el pH del suelo, aumentó la abundancia y diversidad de las BOA pero no produjo cambios significativos en la actividad nitrificante potencial. La estructura de la comunidad de las bacterias nitritantes estuvo dominada por miembros del Grupo 3 de Nitrosospira en todos los tratamientos. Los resultados obtenidos indican que la fertilización con urea a largo plazo en un Argiudol típico representó una fuente de sustrato más que un factor limitante para las BOA. El efecto de la fertilización fue más evidente en el muestreo previo a la siembra de maíz.[/abstract]
Palabras clave: [keygrp scheme="nd"][keyword type="m" language="es"]Fertilización nitrogenada[/keyword]; [keyword type="m" language="es"]Propiedades químicas del suelo[/keyword]; [keyword type="m" language="es"]Comunidad de bacterias oxidantes del amoníaco[/keyword]; [keyword type="m" language="es"]Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante[/keyword][/keygrp].
Impact of the long application of urea on bacteria nitritantes of a typical Argiudol, Argentine
ABSTRACT
[abstract language="en"]Ammonia oxidation to nitrite is a critical step in the nitrogen (N) cycle and is performed by ammonia-oxidizing bacteria (AOB) also called Nitrifying. Agricultural management can affect the AOB community due to the prolonged use of nitrogen fertilizers such as urea which tend to increase soil acidity. After 12 years of urea application, size, activity, AOB composition and chemical variables were investigated. The performed field experiment had a complete randomized block design with three replicates on a typical Argiudol soil located in Marcos Juárez, Southeastern Córdoba, Argentine. The treatments were: A control without N-application; B and C with 95 and 165 kg ha-1 of urea as the N source respectively. Soil samples were collected before sowing and after corn harvest. The AOB community was studied through the most probable number method, shaken soil slurry, polymerase chain reaction and electrophoresis in denaturing gradient gel. Urea fertilization decreased soil pH, increased AOB abundance and diversity but did not significantly affect nitrifying potential. Bacterial community structure was dominated by members of the Group 3 of Nitrosospira in all the treatments. The results showed that the long-term urea fertilization in a typical Argiudol was a substrate source and not a limiting factor for the nitrifying bacteria. The fertilization effect was more evident in the sampling date before corn sowing.[/abstract]
Key words: [keygrp scheme="nd"][keyword type="m" language="en"]Nitrogen fertilization[/keyword]; [keyword type="m" language="en"]Soil chemical properties[/keyword]; [keyword type="m" language="en"]Community of ammonia-oxidizing bacteria[/keyword]; [keyword type="m" language="en"]Denaturant gradient gel electrophoresis (DGGE)[/keyword][/keygrp].[/bibcom][/front]
[body]INTRODUCCIÓN
La nitrificación es el proceso final de la mineralización
de la materia orgánica nitrogenada (Orozco 1999, citado en Miller Gallego,
2012) donde ocurre la oxidación biológica del amoníaco (NH3) a
nitrato (NO3-). Las bacterias oxidantes de amoníaco
(BOA), o nitritantes son microorganismos quimioautótrofos que utilizan la
oxidación de amoníaco (NH3) a nitrito (NO2-)
como fuente de energía, jugando un rol fundamental en el ciclo del nitrógeno
(N) en suelos. La nitrificación genera el sustrato para los procesos de
pérdidas de N por lavado de NO3- y desnitrificación
(Kowalchuk & Stephen, 2001) pudiendo tener efectos negativos para el medio
ambiente por ocasionar la contaminación del agua subterránea o la generación de
gases de efecto invernadero.
Las BOA conforman un grupo funcional utilizado frecuentemente como modelo en
ecología microbiana para estudiar el impacto de las actividades antrópicas
sobre los microorganismos del suelo (Noe & Abril, 2015; Enwall et al.,
2007; Kowalchuk & Stephen, 2001). Si bien las arqueas oxidantes de amoníaco
(AOA) son también capaces de llevar a cabo la oxidación del NH3, se
considera que las BOA demuestran una mayor respuesta a prácticas de
fertilización nitrogenada en estudios a largo plazo con respecto a las AOA
(Shen et al., 2008; Ai et al., 2013).
Para caracterizar la estructura de la comunidad de bacterias nitritantes, los
métodos moleculares, y en particular, el análisis por electroforesis en gel de
gradiente desnaturalizante, en inglés DGGE, ha sido ampliamente
utilizado en diferentes estudios, incluyendo suelos con manejo de fertilización
(Ai et al., 2013; Enwall et al., 2007; Nicolaisen & Ramsing,
2002).
La fertilización es mundialmente utilizada para aumentar el rendimiento de los
cultivos, afectando las propiedades bioquímicas y biológicas del mismo (Ai et
al., 2013). En particular, el uso de fertilizantes nitrogenados puede
influenciar enormemente la disponibilidad de N y el pH del suelo (Ciarlo &
Palma, 2011). La magnitud del efecto acidificante por fertilización nitrogenada
a largo plazo dependerá de factores como el manejo de fertilización, tipo de
suelo y clima (Chien et al., 2008).
En suelos Argiudoles de la región Pampeana el elevado contenido de materia
orgánica del suelo (MOS), entre 2 y 4% y la saturación de bases en el complejo,
superior al 50%, permitirían atenuar el efecto acidificante de la aplicación de
fertilizantes nitrogenados debido a su capacidad buffer (Iturri et al.,
2010; González et al., 2011). En la zona este de la provincia de Córdoba
perteneciente a la región Pampeana Ondulada domina la actividad agrícola y el
manejo de fertilización depende de muchos factores, siendo el económico en
términos de producción, el más importante (Lavado, 2010).
Es bien sabido que, los diferentes sistemas de labranza, la fertilización
mineral y los rastrojos de cultivos afectan a la comunidad de BOA (Yu et al.,
2010). Numerosos estudios a campo en diferentes suelos han estudiado el efecto
de la aplicación prolongada de fertilizantes nitrogenados sobre la comunidad de
las BOA y su estructura. El efecto de la aplicación de fertilizantes
nitrogenados sobre el pH edáfico es determinante, debido a la implicancia de
esta variable ambiental sobre la comunidad de BOA (Enwall et al., 2007;
Ward, 2008; Nicol et al., 2008)
Shen et al. (2008); Yu et al. (2010) y Ai et al. (2013)
observaron que en suelos de textura fina ácidos o moderadamente ácidos y de
textura gruesa alcalinos, el uso de urea afectó positivamente a las BOA
aumentando la abundancia y diversidad con cambios en la estructura de la
comunidad. Mientras que, cuando se aplicó sulfato de amonio en suelos
ligeramente ácidos, los efectos sobre dicha comunidad fueron negativos (He et
al., 2007; Enwall et al., 2007).
Hasta donde alcanza nuestro conocimiento, no se han reportado trabajos que
caractericen a la comunidad de bacterias nitritantes en suelos con buena
capacidad buffer como los Argiudoles de la zona en estudio fertilizados con
urea a largo plazo.
El objetivo de este trabajo fue caracterizar la comunidad de bacterias
oxidantes del amoníaco en un ensayo de larga duración, teniendo en cuenta los
efectos del manejo de fertilización sobre las propiedades químicas del suelo y
rastrojos.
MATERIALES Y MÉTODOS
Descripción del ensayo y
diseño experimental
El trabajo se
realizó en un ensayo establecido en 1993 en la Estación Experimental
Agropecuaria INTA Marcos Juárez (32º 41’ de latitud Sur y a 62º 7’ longitud Oeste) ubicado sobre un suelo clasificado como un Argiudol típico de
textura franco-limoso, con un 3,26% de materia orgánica (MO) y N total de 1,8 g kg-1 de suelo. El pH es de 6,4 clasificado como ligeramente ácido (González et al.,
2011); la CIC 19,3 cmolc kg-1 y una saturación de bases
de 91% (INTA, 1978). La secuencia de cultivos usada en la rotación es
maíz-trigo/soja de segunda-soja de primera bajo siembra directa continua. El
diseño consistió en bloques completos aleatorizados con tres repeticiones. Los
tratamientos fueron: Control, sin aplicación de urea (A); con 90 (B) y 165 (C)
kg ha-1 de N como urea por año. Además se consideró una pastura
natural como situación de referencia (SR). Se realizaron dos muestreos: previo
a la siembra de maíz (con rastrojo de soja1ra. en superficie) el
18/10/2010 y en postcosecha (con rastrojo de maíz) el 27/06/2011.
Recolección y
acondicionamiento de las muestras
Las muestras de suelo
fueron recolectadas de 0-10 cm de profundidad con barreno 2,5 cm de diámetro tomando 30 submuestras por parcela conformando una muestra compuesta.
Conjuntamente se recolectaron rastrojos con aro de 21 cm de diámetro juntando 6 submuestras por parcela para una muestra compuesta.
Las muestras de suelo húmedas fueron conservadas a 4 °C hasta su procesamiento con tamiz de 2 mm. Las determinaciones de abundancia de BOA, actividad o
potencial de nitrificación de suelo (PNS), contenido de N-NO3-
(N de nitrato) y N-NH4+ (N de amoníaco) fueron realizadas
en húmedo, mientras que, las determinaciones de MOS, pH, carbono (C) y N de la
materia orgánica particulada (N-MOP) e incubación anaeróbica se realizaron con
muestra seca. Además, se determinó el contenido de humedad gravimétrica
utilizando la densidad aparente de los primeros 10 cm de suelo. La extracción de ADN genómico se realizó a partir de suelo húmedo conservado a -20 ºC y las extracciones fueron posteriormente almacenadas a la misma temperatura.
Las muestras de rastrojo fueron secadas en estufa a 60 ºC por 48 h, pesadas, molidas y almacenadas hasta las determinaciones de C y N.
Determinaciones químicas
El contenido de C y
N de los rastrojos se cuantificó mediante el método de Combustión en seco
(Merry & Spouncer, 1998) con analizador LECO TrusPec CN.
El contenido de MO del suelo (MOS) se estimó a partir del porcentaje de C
orgánico (CO) (Gasparoni, 2008) mediante el método titulométrico (Walkley &
Black (1934). Para la determinación de la MOP, se realizó el fraccionamiento
por tamaño de partículas con tamiz de 106 µm según Cambardella & Elliott
(1992). Se determinó el contenido de C y N de la MOP siguiendo el mismo
procedimiento que para rastrojos.
Las mediciones de pH se realizaron de acuerdo a una relación suelo-agua de 1:
2,5 (IRAM, 29410. 1999). El contenido de N-NO3- se
determinó mediante el método del ácido Fenoldisulfónico (Bremner, 1965) y el de
N-NH4+ por microdestilación directa por arrastre de vapor (Keeney,
1982).
Determinaciones
microbiológicas
El N potencialmente
mineralizable del suelo proviene principalmente de la fracción de MOP
(Frabrizzi et al., 2003) y su estimación se realizó a través del método
de Incubación anaeróbica de suelo (Echeverría et al., 2000). Dicho
método propuesto por Gianello & Bremner (1986), llamado N anaeróbico (Nan)
consiste en la determinación de NH4+ producido luego de
una incubación de suelo durante siete días a 40 °C en anaerobiosis. La cantidad de NH4+ se cuantificó por microdestilación
por arrastre de vapor (Keeney, 1982).
La abundancia de las BOA se estimó a través del método de recuento del número
más probable (NMP) (Alexander, 1965) en medio líquido selectivo con (NH4)2SO4
y CaCO3 (Frioni, 2006). Los medios fueron incubados durante 28 días
a 29ºC. La actividad enzimática se determinó a través del potencial de
nitrificación de suelo (PNS) por el método Shaken Soil Slurry según
(Drury et al., 2008). El contenido de NO3-
generado en intervalos de tiempo a las 0, 2, 6, 12, 22 y 24 h se cuantificó con
el método del ácido Fenoldisulfónico. La tasa de nitrificación fue determinada
por regresión lineal de las concentraciones de N-NO3- en
el tiempo (h) y la pendiente fue utilizada para determinar el PNS por día (d).
Amplificación por
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y electroforesis
La extracción de
ADN se realizó a partir de 0,5 g de suelo con kit Fast DNA SPIN para suelo (MP
Biomedicals). La calidad del ADN extraído se verificó mediante electroforesis
en agarosa al 1% y la concentración mediante mediciones de absorbancia a 260
nm. Para la amplificación específica del gen 16S ARNr de las BOA se realizó una
nested-PCR (Zhang et al., 2010a citado en Ai et al., 2013). En la
primera amplificación se utilizaron primers específicos para las BOA,
CTO F189 y R654 que amplifican una región de 465 pb (Kowalchuck et al.,
1997). El producto generado fue utilizado como templado para la segunda
amplificación con los primers F341-GC y R534 (Muyzer et al.,
1993). Las condiciones de amplificación fueron según (Muyzer et al.,
1993). Todos los productos PCR fueron chequeados en agarosa al 1% para
verificar su tamaño y calidad. Posteriormente, los amplicones fueron separados
por DGGE. Se prepararon geles de poliacrilamida al 8% conteniendo un
gradiente lineal desnaturalizante de 35 a 60% (donde el 100% de desnaturalizante contiene urea 7M y formamida 40% v/v). Luego se sembraron 38 μL del
producto de PCR por calle. Las condiciones de electroforesis fueron a 60 V
durante 16 h a 60 °C. Los geles fueron teñidos con GelRed en TAE 1X durante 30
min y visualizados bajo luz UV. Los perfiles DGGE fueron digitalizados y
analizados con el software Gel Compare II (Applied Maths). La posición y
la intensidad de las bandas fueron utilizadas para el cálculo de diversidad de
las muestras (mediante el índice de Shannon-Weaver (H’)) y análisis de
conglomerados (AC).
Secuenciación y análisis
filogenético
Las bandas más
destacables en cuanto a la aparición e intensidad en los tratamientos en el
DGGE, fueron aisladas, reamplificadas y sus productos fueron secuenciados. Las
secuencias fueron comparadas con las existentes en la GenBank database del
National Center for Biotechnology Information (NCBI) usando el algoritmo
BLAST. A partir del alineamiento se construyó un árbol filogenético con el
método de Máxima Verosimilitud y el modelo de sustitución Kimura 2 (Kimura et
al., 1980) del software Mega (Tamura et al., 2013). La evaluación
estadística de la topología obtenida se realizó mediante un análisis de
bootstrap (100 réplicas).
Análisis estadístico de
los datos
Para el análisis
estadístico de los datos químicos y biológicos se utilizó el programa INFOSTAT
(Di Rienzo et al., 2014). Se aplicó un Modelo Lineal Mixto, tomando como
efecto fijo los tratamientos de fertilización y como efectos aleatorios, las
épocas de muestreo y repeticiones de campo. Cuando existieron diferencias
significativas en las variables medidas se realizó la prueba de comparación de
medias mediante LSD Fisher con significancias del 5%. Las correlaciones entre
las variables químicas y biológicas se obtuvieron mediante el Índice de
Pearson. Para garantizar la independencia de los datos, las correlaciones
fueron realizadas en cada muestreo por separado. Se informan sólo aquellas
consistentes en ambas fechas y estadísticamente significativas. Además, el
análisis de correlación de Pearson también fue aplicado para estudiar la
relación entre el pH y las bandas estudiadas. La SR no se incluyó en los
análisis estadísticos.
RESULTADOS
Propiedades químicas de los rastrojos y
suelo
La fertilización prolongada con urea
incrementó significativamente (P<0,05) la cantidad de rastrojos y de MOS. No
se detectaron diferencias (P>0,05) en la cantidad de MOP (Tabla
1). El contenido de Nan disminuyó a medida que se incrementó la cantidad de
urea aplicada, siendo significativas sólo las diferencias entre el control y la
dosis mayor (P<0,05). El pH del suelo también disminuyó en respuesta al
agregado de fertilizante, presentando diferencias significativas entre dosis
(P<0,05) (Tabla 1). Los contenidos de N-NH4+
y N-NO3- del suelo también fueron afectados (P<0,05);
el N-NH4+ fue 22% mayor en B con respecto al A, mientras
que C no se diferenció de A y B. El contenido de N-NO-3
aumentó un 27% en C con respecto al tratamiento A, el que a su vez no se
diferenció significativamente de B (Tabla 1).
Tabla 1. Cantidad y calidad de rastrojos de
cosecha; MOP (Materia Orgánica Particulada); MOS (Materia Orgánica de Suelo); Nan
(Nitrógeno anaeróbico); acidez del suelo (pH); N-NO3- ;
N-NH4+ en los tratamientos: A (Sin N); B (90 kg N ha-1) y C (165 kg N ha-1). SR: Situación de Referencia. Dichos valores
fueron estimados por Modelo Lineal Mixto considerando a los muestreos como un
factor aleatorio.
Table 1. Quantity and quality of
crop residues; MOP (Particulate Organic Matter); MOS (Soil Organic Matter); Nan
(anaerobic nitrogen); soil acidity (pH); N-NO3- and N-NH4+
under treatments: A (without N); B (90 kg N ha-1) and C (165 kg N ha-1). SR: Reference soil. These values were estimated by linear
mixed model considering the sampling as a random factor.
Letras distintas indican
diferencias significativas (P< 0,05) según LSD de Fisher.
Letters refer to significant differences (P < 0,05) by Fisher LSD.
Abundancia, diversidad de la comunidad de
las BOA y actividad potencial
La abundancia de BOA fue afectada
significativamente (P<0,05) por la aplicación de urea, aunque no hubo
diferencias entre dosis. El NMP de BOA incrementó un 12% en el tratamiento B y
un 10% en tratamiento C con respecto al control A (Tabla 2).
También la diversidad de BOA fue significativamente mayor (P<0,05) en los
fertilizados. No obstante, el análisis del PNS indica una tendencia decreciente
con la dosis de urea que no resultó significativa (P>0,05) (Tabla
2).
Tabla 2. Valores de abundancia y diversidad
(H’) de BOA y potencial de nitrificación de suelo (PNS) con el error
estándar en los diferentes tratamientos de fertilización y SR (Situación de
Referencia).
Table 2. Abundance and diversity
values (H’) of BOA and Soil Nitrification Potential (PNS) and standard
error in different fertilization treatments and SR (Soil of Reference).
Letras distintas
indican diferencias significativas (P< 0,05) según LSD de Fisher.
Letters refer to significant differences (P < 0,05) by Fisher LSD.
Correlaciones entre las propiedades
químicas y las BOA
El análisis del coeficiente de
correlación de Pearson mostró la existencia de correlaciones positivas y
significativas entre H’ y el N de la MOP en ambos muestreos; detectándose
una correlación con un R2 = 0,75; P= 0,02 en presiembra y un R2
= 0,89; P= 0,001 en postcosecha.
Estructura de la comunidad de las BOA
La estructura de la comunidad fue
caracterizada por DGGE. El análisis se realizó por separado para cada muestreo
ya que las muestras correspondientes fueron corridas en sendos geles. Los
perfiles de banda variaron entre tratamientos en ambos muestreos. En presiembra
(Fig. 1a), la fertilización provocó un aumento en la
riqueza y cambios en la intensidad de las bandas del DGGE. Las bandas 2, 10 y
11 fueron exclusivas de los tratamientos con fertilización; mientras que dos
bandas (8 y 14) fueron propias del control. Adicionalmente, se detectaron
diferencias en la intensidad de algunas bandas entre el control y los
tratamientos. Las bandas 3, 4, 12 y 16 fueron más intensas en B y C, mientras
que las bandas 7 y 19 presentaron un comportamiento opuesto. El test de Pearson
reveló correlaciones negativas entre la abundancia de las bandas 2 y 16 con el
pH (R2 = - 0,81; P= 0,004; R2 = -0,76; P= 0,001,
respectivamente); mientras que con la banda 19 la correlación con el pH fue
positiva (R2 = 0,91; P= 0,0001) indicando que a medida que disminuye
el pH también lo hace esta población de BOA.
Figura 1. DGGE de BOA correspondiente al
primer muestreo (presiembra de maíz) para los diferentes tratamientos de
fertilización A: Sin N; B y C: con 90 y 165 kg N ha-1 respectivamente y SR: Situación de Referencia (a); y Dendrograma de similitud (UPGMA y Coef.
Correlación Pearson, expresado en porcentaje) (b). Las líneas blancas señalan
las bandas secuenciadas y las fechas negras aquellas que correlacionan con el
pH. Los números romanos representan las tres repeticiones de campo para cada
tratamiento.
Figure 1. DGGE of BOA for the
first sampling (prior to sowing of corn) with different fertilization treatments
A: without N.; B and C: 90 and 165 kg N ha-1 respectively and SR:
Reference soil (a); and Dendrogram similarity (UPGMA and Correlation
Coefficient of Pearson, expressed in percentage) (b). The white lines indicate
the bands sequenced and black arrows indicate bands correlating with pH. Roman
numerals denote the three field replicates for each treatment.
En postcosecha, se detectó menor variación en los perfiles entre los tratamientos evaluados (Fig. 2a) mostrando que la composición de la comunidad de BOA fue muy similar. Los resultados son confirmados por los dendrogramas de similitud del AC (Figs. 1b y 2b). En presiembra el tratamiento A se separó de B y C a un 85,1% de similitud. A su vez dentro de los fertilizados hubo discriminación entre dosis de fertilización. Por otra parte, en postcosecha, la estructura de las BOA presentó mayor similitud (93,5%) entre los patrones con respecto a presiembra, sin embargo, la variación estructural se mantuvo, mostrando la separación de B y C con respecto al tratamiento A.
Figura 2. DGGE de BOA correspondiente al
segundo muestreo (postcosecha de maíz) para los diferentes tratamientos de
fertilización A: Sin N; B y C: con 90 y 165 kg N ha-1 respectivamente y SR: Situación de Referencia (a); y Dendrograma de similitud (UPGMA y Coef.
Correlación Pearson, expresado en porcentaje) (b). Los números romanos
representan las tres repeticiones de campo para cada tratamiento.
Figure 2. DGGE of BOA for the
second sampling (after harvesting of corn) in different fertilization
treatments A: without N.; B and C: 90 and 165 kg N ha-1 respectively and SR: Reference soil (a); and Dendrogram similarity (UPGMA
and Correlation Coefficient of Pearson, expressed in percentage) (b). Roman
numerals denote the three field replicates for each treatment.
Las bandas 6, 7, 12, 14, 15, 16 y 19 fueron seleccionadas del DGGE (Fig. 1a) y secuenciadas para determinar su identidad y relaciones filogenéticas. El análisis reveló que dichas secuencias presentaron elevados porcentajes de identidad con cepas de las especies Nitrosospira tenuis, Nitrosospira multiformis mientras que dos fueron afines a secuencias de clones de β Proteobacterias oxidantes del amoníaco no cultivables (Tabla 3). Los perfiles DGGE estuvieron dominados por miembros del género Nitrosospira siendo la mayoría clasificadas como miembros del Grupo 3 de Nitrosospira (Fig. 3). No se detectaron afiliaciones filogenéticas con el género Nitrosomonas.
Tabla 3. Bandas de BOA recortadas del DGGE,
secuencias conocidas de mayor similitud en el Gen Bank, porcentaje de similitud
y origen de las mismas.
Table 3. AOB DGGE bands with
closest matches in Gen Bank percentages of similarity, and sources of origin.
Figura 3. Árbol filogenético de las secuencias
parciales del ADNr 16S de BOA, correspondientes a las bandas seleccionadas del
DGGE y las secuencias con mayor similitud obtenidas de GenBank. Las secuencias
correspondientes a este estudio se muestran en negrita. La escala indica % de
sustituciones. Los valores bootstrap se muestran en los nodos.
Figure 3. Phylogenetic tree of
partial AOB 16S rDNA sequences of DGGE selected bands in relation to 16S rDNA
sequences of the closest uncultured and cultured relatives from genbank. Band
sequences from this study are labeled in bold. The scale bar indicates %
nucleotide substitutions. Bootstrap values are reported at the nodes.
DISCUSIÓN
La aplicación de urea a largo plazo en un
suelo Argiudol típico incrementó la abundancia y diversidad de las BOA en
relación al tratamiento sin fertilizar, demostrando que el N aportado es un
factor preponderante como sustrato frente a la acidificación causada por la
fertilización.
El pH disminuyó en los tratamientos con urea en forma similar a lo informado en
otros trabajos (Fabrizzi et al., 1998; Divito et al., 2011;
Wyngaard et al., 2012). Sin embargo, la abundancia, diversidad de las
BOA y el potencial de nitrificación del suelo no fueron afectados negativamente
por la acidificación del suelo. Esto concuerda con datos bibliográficos de
suelos ligeramente ácidos y alcalinos donde se observó mayor abundancia
(Biederbeck et al., 1995; Chu et al., 2008; Shen et al.,
2008) o un incremento en la diversidad de BOA (Chu et al., 2007; Yu et
al., 2010; Ai et al., 2013) al aplicar urea a largo plazo a pesar de
la disminución en el pH edáfico.
Según Frioni (2006) el proceso de nitrificación se ve favorecido debido al
elevado aporte de N por fertilización nitrogenada. En este estudio, el
incremento de N aportado quedó demostrado por el mayor contenido de N-NH4+
detectado en las parcelas con aplicación de urea. El mismo resultado fue
observado por Chen et al. (2011) y Yu et al. (2010) en ensayos de
larga duración. El aumento N mineral encontrado en los tratamientos
fertilizados, podría derivar tanto del aporte del fertilizante, como así
también del mayor aporte por mineralización de los rastrojos, producto del
incremento en el rendimiento agrícola asociado a la fertilización (Diovisalvi et
al., 2008). Según Nieder et al. (2010), además de los fertilizantes,
los rastrojos de cultivos y MOS afectan la concentración de N-NH4+
en la solución del suelo.
En coincidencia con estudios previos en ensayos con fertilización nitrogenada a
largo plazo (Divito et al., 2011; Gregorutti et al., 2014), los
tratamientos con urea generaron una disminución significativa del Nan, que
representa una medida del N potencialmente mineralizable (Echeverría et al.,
2000; Fabrizzi et al., 2003). Este efecto se atribuye a un aumento en la
velocidad de mineralización de la MOP como consecuencia de la aplicación de N
(Galantini et al., 2008). No se detectó relación entre el N
potencialmente mineralizable y las BOA, pero sí se observaron correlaciones
positivas y significativas entre la diversidad de BOA con el N de la MOP,
indicando que posiblemente a partir de su mineralización por microorganismos
heterótrofos, actuaría favoreciendo a la comunidad nitrificante.
La concentración de N-NO3- aumentó en los tratamientos
con urea al igual que en otros trabajos de fertilización nitrogenada a largo
plazo (He et al., 2007; Chu etal., 2007; Shen et al.,
2008; Yu et al., 2010), pero la actividad nitrificante potencial no fue
afectada. Resultados similares fueron publicados por Yu et al. (2010) al
comparar suelos fertilizados con urea y un control sin fertilizar en ensayos de
larga duración.
A pesar de no haberse detectado cambios significativos en el PNS, este mostró
una tendencia decreciente que podría estar relacionada con la disminución del
pH. La acidificación del suelo no afectó en forma negativa la abundancia y
diversidad, pero es posible que haya generado una selección de especies
tolerantes o acidofílicas. Ha sido demostrado que las especies de BOA capaces
de crecer en condiciones ácidas poseen una ureasa intracelular que les permite
tomar urea directamente del medio, superando de esta manera el inconveniente de
la protonación del amoníaco a pH bajos (Burton & Prosser, 2001;
Pomme-rening-Röser & Koops, 2005). Esta capacidad les permite competir
exitosamente en su ambiente, sin embargo, es posible que tengan una menor
velocidad de oxidación dando lugar a un menor potencial de nitrificación en
condiciones in vitro. Las correlaciones observadas entre algunas
poblaciones de BOA y el pH reflejarían su adaptación o la falta de
competitividad frente a la acidez del suelo. En forma similar, la selección de
distintos linajes de BOA a lo largo de un gradiente de pH fue observada
anteriormente por Nicol et al. (2008), y podría explicarse de acuerdo a
Pommerening-Röser & Koops (2005) por los diferentes pHs óptimos para el
transporte de urea de las distintas poblaciones.
La sensibilidad de la comunidad de las BOA frente a la aplicación de urea fue
demostrada por los dendrogramas de similitud. Dicho análisis reveló que la
estructura de la comunidad de las BOA fue afectada por la fertilización en
diferente magnitud de acuerdo a la época de muestreo. En presiembra, en los
tratamientos fertilizados se observó un patrón de bandas más diverso con
respecto al control, mientras que en postcosecha las diferencias fueron
menores. Otros trabajos obtuvieron resultados similares a los observados en
presiembra, donde la fertilización con urea a largo plazo aumentó no sólo la
intensidad de bandas con respecto al testigo sino que además incrementó el
número de bandas o riqueza en el perfil DGGE (Shen et al., 2008; Yu et
al., 2010; Ai et al., 2013). A su vez en presiembra se observa una
separación específica a nivel de dosis, mientras que en postcosecha la misma no
es evidente. Estas diferencias entre muestreos, podrían ser explicadas por la
disponibilidad diferencial de N. En presiembra las condiciones de mayor
mineralización de N determinadas por el rastrojo de soja estimularían cambios
más evidentes en la composición de BOA; mientras que en postcosecha la
presencia de rastrojo de maíz favoreció la inmovilización de N, lo cual está
asociado al cese de la actividad microbiana (Ernst, 2002). A su vez, Wright et
al. (2005) observaron una fuerte influencia de especies de plantas y
residuos de cosecha sobre la diversidad microbiana del suelo. Si bien el diseño
de los muestreos en el presente trabajo no permite asegurarlo, sería
interesante determinar si estas diferencias se deben a los rastrojos presentes
en superficie o a factores climáticos o estacionales, ya que ha sido demostrado
en distintos ambientes que las BOA presentan un comportamiento estacional
(Taylor et al., 2012; Bouskill et al., 2011).
Las poblaciones dominantes se afiliaron filogenéticamente al Grupo 3 de Nitrosospira
comúnmente detectado en ambientes terrestres principalmente en suelos agrícolas
(Kowalchuck & Stephen, 2001). La detección del género Nitrosospira y
la ausencia de Nitrosomonas es consistente con otras investigaciones
(Kowalchuck et al., 1997; Chu et al., 2007; Yu et al.,
2010) que señalan la dominancia de Nitrosospira en suelos. Más allá de
que algunos trabajos han encontrado que la aplicación de fertilizantes
nitrogenados a largo plazo promueve la dominancia del Grupo 3 de Nitrosospira
(He et al., 2007; Yu et al., 2010), en este estudio las
poblaciones afiliadas al Grupo 3 fueron detectadas también en el control sin
aplicación de N. De acuerdo con lo observado por Chu et al. (2007) en
tratamientos con y sin aplicación de urea a largo plazo, y por Avrahami et
al. (2003) dicho grupo no necesariamente es dominante en condiciones de
elevada concentración de amonio y fue encontrado tanto en suelos fertilizados
como en controles sin aplicación de N.
La elevada versatilidad de las BOA pertenecientes al Grupo 3 (Avrahami et al.,
2003) se ve reflejada en su ubicuidad en distintos tipos de suelos (Fierer et
al. 2009 citado en Glaser et al., 2010). La presencia de poblaciones
con elevada similitud a clones de Nitrosospira no cultivables obtenidos
de estanques mineros (Sow et al., 2014), estaría relacionada con esta
característica general de las BOA (Hiorns et al., 1995; Kowalchuck &
Stephen, 2001).
Nuestros resultados demuestran que el manejo de fertilización con urea a largo
plazo en un suelo Argiudol típico de la Argentina no produjo efectos negativos
sobre la comunidad de BOA, las que a su vez respondieron con cambios en la
abundancia y estructura demostrando su sensibilidad al manejo agrícola.
CONCLUSIONES
La fertilización nitrogenada prolongada con urea aumentó el aporte de rastrojos y MOS, pero no generó cambios en la materia orgánica particulada. No obstante, a partir de la mineralización, el N de dicha fracción podría actuar como sustrato para los microorganismos nitrificantes del suelo. La disminución del pH edáfico, no afectó negativamente a la comunidad de nitritantes. La urea representó una fuente de sustrato a partir del aporte de N, aumentando la abundancia y diversidad de las BOA. La actividad nitrificante potencial no reflejó estos cambios, sin embargo, el contenido de nitrato fue mayor en los tratamientos con aplicación. La estructura de la comunidad de BOA mostró cambios en respuesta a la fertilización y estuvo dominada por miembros del Grupo 3 de Nitrosospira.[/body]
[back]AGRADECIMIENTOS
Los resultados presentados en este trabajo son parte de la Tesis de Maestría de la primera autora, en el Programa de Postgrado en Ciencias Agropecuarias de la Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Nacional de Córdoba. La primera autora desea expresar un profundo agradecimiento a la Dra. María Basanta y Ms. Laura Torres por el asesoramiento y colaboración en la redacción de este trabajo. Este estudio fue financiado por los Proyectos Específicos AEBIO 242441 (2010-2013) y PNS 1134043 de INTA. ELMF es miembro de la carrera de investigador científico de CONICET.
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